Основы инженерной энзимологии

Сущность способа иммобилизации ферментов в полупроницаемые структуры заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы. Первый способ предложен Т. Чангом в 1964 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонденсации двух соединений, одно из которых растворено в водной, а другое – в органической фазе. Примером может служить образование на поверхности раздела фаз микрокапсулы, получаемой путем поликонденсации гексаметилендиамина – 1,6 (водная фаза) и галогенангидрида себациновой кислоты (органическая фаза).

nН2N(CH2)6NH2+nClC(O) (CH2)8C(O) Cl = (-NH(CH2)6NHC(O) (CH2)8C(O)-)n+2nHCl

К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Близким к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента. Ферменты, иммобилизованные путем включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибо значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса биологических мембран.

Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем – наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов. В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Все методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы носителя, вступающей во взаимодействие с молекулой фермента.

1) Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксогруппами.

Наиболее распространенным методом образования ковалентной связи между ферментом и полисахаридным носителем или синтетическим диольным соединением является бромциановый метод, который был предложен Р. Аксеном, Дж. Поратом и С. Эрнбаком в 1967 г. При обработке носителя бромцианом возникают реакционноспособные цианаты и имидокарбонаты, которые при взаимодействии с нуклеофильными аминогруппами фермента образуют производные изомочевины и уретанов.

Н-OH+BrCN = H-OCN+H2N-Ф=H-OC(NH) – NH-Ф

2) Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих аминогруппами.

Первичные аминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом, предварительно превращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные, гуанидиновые, тиольные группы белков. Н-N2++H2N-Ф = H-N=N-NH-Ф+Н+

3) Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы.

Наиболее часто для соединения аминогрупп белка с ацильными группировками носителя используют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие производные карбоновых кислот.

Н-С(О) Cl+H2N-Ф = H-C(O) NH-Ф+НCl

4) Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрильными группами.

Сульфгидрильные группы носителя и фермента легко окисляются с образованием дисульфидных связей под действием кислорода воздуха.

H-SH+0,5О2+HS-Ф = Н-S-S-Ф+Н2О

Наряду с иммобилизацией ферментов в последнее время все большее внимание уделяется иммобилизации клеток и субклеточных структур. Это объясняется тем, что при использовании иммобилизованных клеток отпадает необходимость выделения и очистки ферментных препаратов, применение кофакторов; создается возможность получения полиферментных систем, осуществляющих многостадийные непрерывно действующие процессы.

Информация по педагогике:

Понятие о подвижной игре
Подвижной называется игра, построенная на движениях. Целевая установка и виды деятельности играющих определяются сюжетом (замыслом, темой) данной игры. Правила уточняют права и обязанности участников, определяют способы ведения и учета результатов игры. Для подвижных игр характерны самостоятельные, ...

Деятельность классного руководителя
Реализация модели классного руководителя XXI в. предполагает осуществление определенных задач, цели и содержания деятельности классного руководителя. Целью деятельности классного руководителя является организация целостного педагогического процесса и осуществление его руководства. Определяющим комп ...

Методические рекомендации по изучению элементов теории множеств в начальном курсе математике
Знакомство с множествами и операциями над ними имеет важное значение для дальнейшего изучения многих вопросов школьной программы по математике и вместе с тем способствует интенсивному развитию мыслительных операций и речи учащихся: дети постоянно должны сравнивать объекты, выявлять в них сходства и ...