Основы генетической инженерии

Биотехнология рекомбинантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК включает набор, как новых методов, так и заимствованных из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методы существенно расширяют возможности генетических исследований. К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК следует отнести следующие:

Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что в значительной степени ускоряет выделение различных генов и манипуляции с ними.

Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида.

Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания.

Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК-фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.

Генетическая инженерия, позволяющая получать модифицированные версии генов (сайт-спецефический мутагенез и т.д.) и затем внедрять их в клетки или организмы.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами – рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4–6 нуклеотидов (сайт узнавания). Соответствующие последовательности в геноме бактерий замаскированы метилированием остатков с помощью метилаз.

Для успешного решения задач генетической инженерии очень важно быстро секвенировать (определять последовательность нуклеотидов) любых очищенных фрагментов ДНК[8]. В середине 70-х г. в этой области произошел решительный перелом, связанный с открытием рестриктаз и усовершенствованием метода гель-электрофореза, когда стало возможным разделять достаточно протяженные фрагменты ДНК, отличающиеся размером всего на один нуклеотид. С помощью рестриктаз ДНК стали разрезать на определенные блоки и определять в них позиции нуклеотидов химическими (А. Максам и У. Гилберт 1976) или энзиматическими (Сангер и Коулсон 1975) методами.

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100ºС в сильно щелочной среде (рН 13). При нагревании до 100ºС комплементарные пары оснований разрушаются, и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65ºС приводит к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»).

Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro.

Для эффективного введения (трансформации) необходимо иметь достаточное число копий нуклеотидных последовательностей.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод амплификации фрагментов нуклеиновых кислот in vitro, с помощью которого можно достаточно быстро (в течение нескольких часов) получить миллионы копий определенных нуклеотидных последовательностей (генов). Метод был предложен в 1985 г. К. Мюллисом (биотехнологическая корпорация «Cetus», США) и получил широкое распространение в 1988 г., когда Р. Сайки с соавт. была опубликована основополагающая работа по теории ПЦР и её оптимизации. Метод ПЦР, названный «изобретением века» и очень скоро, в 1993 г., отмеченный Нобелевской премией, ускорил реализацию программы «Геном человека», а также способствовал внедрению в практику клинической диагностики многих заболеваний высокоэффективных диагностических наборов нового поколения.

В методе ПЦР для амплификации фрагментов ДНК используют термоустойчивую ДНК-полимеразу из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимеразу), которая в присутствии всех 4 видов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и коротких 20–30-членных затравок (праймеров) осуществляет синтез комплементарных последовательностей ДНК. ПЦР имеет циклический, включающих нагревание и охлаждение проб, и цепной характер, так как синтезированные фрагменты ДНК в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез. Повторяя циклы амплификации 30–40 раз, за 1,5 – 3 ч получают миллионы копий фрагментов ДНК.

Информация по педагогике:

Методические рекомендации по использованию народных примет как средства развития внимания
Для работы с народными приметами в курсе "Окружающий мир" учителю нужно следовать методическим рекомендациям: 1) Использование народных примет должно быть систематическим, на каждом уроке окружающего мира. 2) Для работы на уроке не следует брать большого количества примет, достаточно пяти ...

Функции классного руководителя
Педагог как руководитель классного коллектива реализует свои функции относительно всего класса в целом и каждого ученика в отдельности. Воспитательные задачи классный руководитель решает в соответствии с учетом возраста детей и взаимоотношений внутри класса, учитывая при этом индивидуальные особенн ...

Объем дисциплины и виды учебной работы
Вид учебной работы Всего часов I уровень II уровень III уровень Общая трудоемкость дисциплины 70 –120 120 – 180 180 –330 Аудиторные занятия 35 – 60 60 – 90 90 – 165 Лекции 20 – 30 30 – 45 45 – 85 Практические занятия (ПЗ) 0 – 15 15 – 20 15 – 35 Семинары (С) Нет Нет Нет Лабораторные работы (ЛР) 15 – ...