Основы генетической инженерии

Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и поставляется на фармацевтические предприятия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г. кристаллического инсулина необходимо 800–1000 кг исходного сырья. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках E.coli (рис. 6).

Рис. 6. Экспрессия гена проинсулина человека в составе гибридного белка с β-галактозидазой

Был синтезирован и ген соматостатина – гормона гипоталамуса. Соматостатин подавляет выделение инсулина и гормона роста человека. В Национальном медицинском центре «Хоуп» (Калифорния) был осуществлен химико-ферментативный синтез гена длиной в 42 нуклеотида, способного кодировать соматостатин. Синтетический ген соматостатина был встроен в плазмиду pBR322 E.coli вблизи конца гена, кодирующего фермент β-галактозидазу. Между двумя генами был помещен кодон метионина. После введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку кишечная палочка стала синтезировать гибридный белок. Часть его (соматостатин) затем отщепляли от β-галактозидазы BrCN. Первый синтез соматостатина генно-инженерным способом был осуществлен в 1977 г. Бойером. Выход гормона составил 10 000 молекул на одну клетку. Из 100 г. биомассы E.coli, выращенной в ферментере объемом 8 л, удалось выделить 5 мг соматостатина, т.е. столько, сколько можно его выделить из 100 кг овечьих мозгов.

Соматотропин (или гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию – гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Обычно его получают из гипофиза трупов, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости в развитых странах. Препарат из трупного материала представляет собой смесь из нескольких форм. Это приводило к тому, что у 30% больных, получавших препарат, против гормона вырабатывались антитела, сводившие на нет его биологическую активность. Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГРЧ синтезируют методами генетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Биосинтез ГРЧ был осуществлен в 1979 г. Д. Гедделем с сотрудниками. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100 000 молекул гормона на клетку.

Проблема введения генов в клетки млекопитающих очень важна для исследования функционирования генов высших эукариот.

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соединенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК--клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК+-клетками. Клетки ТК+ легко отличаются от клеток ТК-, поскольку способны расти на средах с аминоптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов). Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных были использованы гибриды бактериальных плазмид с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках E.coli и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК–клетки.

Представляют немаловажный интерес микроинъекции ДНК непосредственно в ядро клетки. Её осуществляют с помощью специальной пипетки (внутренний диаметр её около 1 мкм), а количество инъецированного раствора ДНК составляет 1–2 пкл. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы, и плазмиды pBR322 были инъецированы в ТК-клетки, при этом ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался. Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку. Таким образом, были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген глобина кролика, ген тимидинкиназного вируса герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Несмотря на определенные успехи в области интеграции чужеродных генов в эмбриональные клетки животных, до сих пор не удалось встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы, вытеснить ген и заменить его новой нуклеотидной последовательность, подчинить новый ген системе регуляции организма.

Информация по педагогике:

Типовые различия в характеристиках компонентов математических способностей
Существование различных типов математических складов ума есть следствие не только индивидуальных и типовых психологических различий между людьми, но и следствие различных требований, которые предъявляют человеку разные разделы математики. Эксперименты на ребятах от 11 до 14 лет показали, что в зави ...

Разработка темы «Основания» в курсе неорганической и органической химии
Цели урока: познакомить учащихся с новым классом химических соединений – основаниями, их свойствами (отношение к воде, действие на индикаторы, взаимодействие с кислотами), практическим использованием оснований в быту и народном хозяйстве; развивать умения работать с химическим оборудованием и реакт ...

Индивидуальные различия в пространственном мышлении
Пространственное мышление — специфический вид мыслительной деятельности, которая необходима при решении задач, требующих ориентации в пространстве (как видимом, так и воображаемом), и основывается на анализе пространственных свойств и отношений реальных объектов или их графических изображений. Глав ...